代谢相关脂肪性肝病（MASLD）波及全球超过30%人口，它不仅已成为导致终末期肝病的主要因素，还与多种慢性、系统性疾病（包括癌症、心血管疾病和肾功能障碍）密切相关。MASLD在组织学上表现为从单纯脂肪变性到脂肪性肝炎，再到进行性瘢痕形成（即疾病的不同分期）。MASLD的病情发展过程极为复杂。目前，阻止其病情进展的治疗方法效果有限。因此，科学家们正在能够早期发现脂肪变性的生物标志物，为预防MASLD提供更加科学的依据。尽管缺乏组织活检这一参考金标准，但通过大型队列研究和先进的成像技术，以及血液中的基因组和非基因组生物标志物，已经发现了一些有潜力的早期生物标志物，如PNPLA3。然而，单凭基因变异并不能完全解释行为和环境因素（如饮食、肥胖和糖尿病）对脂肪变性的影响。这些因素在更接近脂肪变性的其他分子状态中有所体现，如循环蛋白质组学和肝组织图谱。此外，肝脏活检虽然常用于二级护理中检测已确诊的疾病，但在大型研究中，这种方法针对高风险人群既不道德也不实际。因此，建立一个转化资源库，将分子洞察力与大型队列流行病学、现代肝脏成像技术以及临床结果的力量相结合，对于识别预后生物标志物至关重要。这些生物标志物可能会成为下游机理研究和治疗开发的目标。
在这项研究中，科学家们的目标是建立一个转化医学资源库，用于研究人类的代谢相关脂肪肝疾病（MASLD）。他们通过分析大量人群的临床蛋白质组数据，并结合非侵入性测量肝脏脂肪变性的方法和肝脏组织的动态变化，试图找到与MASLD相关的循环蛋白质。研究团队通过利用三个大型、前瞻性、跨国队列（≈5,000人），覆盖了广泛的代谢风险人群，使用不同的非侵入性方法来测量肝脏脂肪变性，并识别出与疾病相关的蛋白质。他们评估了这些肝脏脂肪变性相关的蛋白质组特征在更大规模样本（超过26,000人）中对MASLD预后和相关临床结果的影响。为了更深入理解这些生物标志物并增强其组织特异性，科学家们使用了肝脏芯片模型来监测肝脏脂肪变性过程中细胞特异性转录和蛋白质的动态变化。他们的最终目的是验证一种整合循环蛋白质组、组织转录组和蛋白质组以及人体模型的方法，是否能在人体肝脏的动态代谢过程中找到生理上合理的靶点，以期将临床生物标志物的发现与肝脏的生物学紧密联系起来。
本研究包括6个步骤，具体包括：（1）识别并验证与“肝脂肪变性”相关的蛋白质组（涉及三项前瞻性观察研究，共4996名参与者），(2)探究该蛋白质组与肝脂肪变性相关的临床结果之间的联系（对英国生物银行的26,421名参与者进行了长达13.7年的中位随访），(3)分析组织来源和相关分子通路的特性，(4)在完整的MASLD活动和阶段谱系中，研究编码肝脏脂肪变性蛋白质组的基因在人类肝脏中的表达模式，(5)明确这些基因在患有和未患有MASLD的人类肝脏中的细胞类型和空间分布，(6)在人源化肝脏芯片平台上进行靶标测试，以观察转录变化是否随着脂肪变性的诱导而发生，并研究这些变化是否影响蛋白质的合成。
整体研究策略图
总体而言，科学家们的研究共纳入了2,679名CARDIA研究参与者，但排除了那些可能患有继发性肝病的参与者、肝功能异常或脂肪变性的潜在次要原因（即非MASLD）。
群体阵列研究基本特征
在对2,679名参与者的SomaScan 7k蛋白质组学研究中，科学家们在推导样本和验证样本中识别出与肝衰减相关的237个独特蛋白质（肝衰减越低，肝脂肪变性越严重）（见图1A和1B）。研究发现，流行病学研究中的蛋白质靶标在转录水平（图1C）和组织蛋白质组水平（图1D）上的表达明显富集，指明了与中央代谢过程（如碳、丙酮酸、氨基酸、钙、镁）有关的广泛通路，碳、丙酮酸、氨基酸和碳水化合物代谢和纤维化（图1E），包括已知和新出现的MASLD机制，例如氨基酸代谢（ACY18,12和FAH13）、酒精加工（如ADH1A14,15）和纤维化（图1F）、氨基酸代谢（ACY18,12和FAH13）、酒精加工（如 ADH1A14,15）、果糖分解（ALDOB和SORD16）、胆汁酸和类固醇代谢（AKR1D117和AKR1C418,19）、糖代谢（FBP120）以及多底物解毒、中间代谢和纤维化（GSTA1,21 ASL,22和UGDH23）等。
为了进一步确定 MASLD潜在的核心介导因子，科学家们进行了相互作用（中心基因）分析，找出了与MASLD核心相关的基因（图1F）。这些基因涉及肝细胞再生和纤维化调控的致病介质（表皮生长因子受体25和IGF-126）、细胞凋亡调控（MET27）、炎症介质（CXCL2、28 CRP和SERPINE1）、 肝损伤的细胞外基质反应（VTN29和ACAN30）、糖原代谢（PYGL31）和线粒体丙酮酸代谢（PKLR32和 PC33），以及其他一些胰岛素敏感性和脂肪堆积的典型标志物（ADIPOQ和 INS）。这些结果表明，循环中的MASLD蛋白质组主要来源于肝脏，并与肝脏变性中的典型代谢-炎症-纤维化途径有关。
图1与肝脏脂肪变性有关的蛋白质主要在肝脏中表达，并确定新陈代谢的途径
科学家们在对年龄、性别、种族和体重指数进行调整后，建立了一个自适应肝衰减模型（以下简称为 “MASLD评分”）。在推导子样本和验证子样本中，MASLD评分与肝脏衰减显示出显著的相关性（Spearmanρ = 0.69和0.56，图2A），并且当验证子样本仅限于符合MASLD临床标准的参与者时，MASLD评分依然表现出相似的相关性。科学家们发现，体重指数与MASLD评分之间存在一定的相关性（Spearmanρ = -0.27，p < 2.2× 1016），而年龄、性别、种族和酗酒的影响则相对较小。
接下来，科学家们进行了研究，以确定MASLD评分是否与临床结果有相关性，特别是与心血管疾病、糖尿病（肝脏脂肪变性已知相关）和MASLD本身的临床结果。他们分析了英国生物库（UK Biobank）中26,421名参与者的数据，发现MASLD评分与MASLD及相关代谢结果有广泛的相关性（图2D）。研究还表明除了全因死亡率和病因特异性死亡率（尤其是癌症）之外，MASLD评分（评分越低，脂肪变越多）与慢性非酒精性肝病和糖尿病的发生油显著关联。即使在考虑了其他可能影响结果的因素（如肝酶AST、ALT和糖尿病指标A1c）后，这些关联依然存在。在心血管和癌症相关死亡率方面，竞争风险模型（Fine-Gray subdistribution hazard model）提供的估计值与病因特异性模型相似（心血管死亡率HR 0.96，95% CI 0.88-1.06；癌症死亡率HR 0.90，95% CI 0.84-0.97）。在糖尿病和慢性非酒精性肝病的临床模型（包括年龄、性别、种族、体重指数、收缩压、糖尿病[在糖尿病模型中移除]、汤森贫困指数、吸烟、饮酒和低密度脂蛋白）基础上，加入MASLD评分能显著提升辨别和再分类指标（图2D）。进一步调整谷草转氨酶、谷丙转氨酶和A1c后，慢性非酒精性肝病的发病模型也很稳健。
图2肝脂肪变性蛋白质组评分的建立及其与临床结果的关系
科学家们为了更好地理解蛋白质组分析中识别出的关键蛋白质靶点在人体肝脏中的具体位置和分布情况，借助了已有的单细胞RNA测序数据和肝细胞图谱的空间转录组学数据，将CARDIA临床蛋白质组回归中确定的蛋白质与其在人类肝脏中的基因表达进行了映射。研究中涉及的样本不仅包括了空间转录组学数据，还包含了scRNA-seq数据。通过这些数据，科学家们能够广泛识别细胞类型，并根据其与人类肝脏内肝脏脂肪变性的关系确定优先靶点的空间分布。科学家们利用单基因表达量和综合表达量评分（图3）对在scRNA-seq和空间转录组学数据集中表达的237个与脂肪变性相关的蛋白质中的198个蛋白进行了表达谱分析。结果显示，这一分析表明主要在肝细胞中观察到的受牵连靶点的细胞特异性表达模式占主导地位，同时在成纤维细胞、胆管细胞、内皮细胞和免疫细胞等多种类型的细胞中都发现了靶点的表达（图3A）。通过综合表达评分，科学家们还发现，在脂肪变性组织内和肝脏中轴区，相关靶点的基因活性较高。先前的研究也指出，在该数据集中的这些区域与较高的肝细胞表达特征相对应（图3B-3F）。
图3肝脂肪变性蛋白质组的转录结构
接着，科学家们利用空间转录组学来检测蛋白质组学确定的相关靶点是否会在肝组织中表现出差异表达。通过分析，他们发现，在空间转录组学数据中，与脂肪变性相关的198个蛋白-基因中，有33个基因在健康组织和脂肪变性组织之间表现出显著的差异表达（最小表达量>10%，经假发现率[FDR]调整后p < 0.05；|log2折合变化|>0.25；以及最小表达量%点差异>10%；图3H）。在这33个基因中，有30个基因在脂肪变性组织中表达量增加，3个基因（IGFBP2、IL1RAP和SHBG）表达量减少。这些基因在有无脂肪变性的肝脏组织中的呈现出不同的表达模式（图 3H）。此外，研究还显示，在人类肝脏中，脂肪区与非脂肪区域之间的RNA表达差异与CARDIA研究中循环蛋白的临床效应大小之间存在生物学方向上的一致性（图3G）。具体来说，CARDIA回归系数越大，表明健康肝脏区与脂肪肝区的蛋白表达差异越大；脂肪变性程度越低，组织RNA表达量越高。
随后，科学家们将这33个差异表达基因与NASH-CRN定义的肝脏脂肪变性阶段的大量转录组数据进行了比对分析，以研究随着组织病理学表型严重程度逐渐增加的个体的潜在动态变化（图4）。研究涉及了499名患有MASLD并接受了活检的SteatoSITE参与者（其中47%为女性，中位年龄53岁，中位体重指数31 kg/m2，31%患有糖尿病）与34份对照样本进行了比较。研究发现，在这33个基因中，有12个基因在所有脂肪变性阶段都没有显著的表达差异，因此这些基因没有被包含在最终的可视化分析图（图4）中。科学家们在研究脂肪变性时发现，不同的基因在不同脂肪变性等级中的影响程度有显著差异，并且这些发现与循环蛋白组学和空间关系的研究结果是一致的。例如，IGFBP2、IL1RAP、SHBG、ENO3、DEGB1和ME1，某些基因在不同纤维化阶段也表现出一致性。然而，在蛋白质组和空间研究中，科学家们发现了两大类不一致的现象：一种是某些基因的表达方向与蛋白质组空间转录结果一致，但与总体转录结果不一致（如SERPINE1/PAI-143,44,45和HSPA1B46）；另一种是基因的表达方向与总体转录结果一致，但与蛋白质组空间转录结果不一致（如 PSAT1,47 UDGH,23和 ACO148）。造成这些差异的因素可能包括：技术因素（测序方法、体细胞与单细胞、先前发表的scRNA-seq数据集样本量有限）、参与者水平和生物学因素（脂肪变性是MASLD表型的一个组成部分，此外还有炎症、气球化和纤维化）。尽管存在这些不一致，这些研究结果还是显示了蛋白质转录靶标图谱在人类MASLD中的重要性，而正确绘制这一图谱需要考虑到上下文的异质性以及多种方法整合的复杂性。
图4不同脂肪变性阶段人类肝脏空间靶点的转录异质性
科学家们为了验证不同肝细胞中脂肪变性相关基因的转录变化与MASLD蛋白体组的直接关联，利用Emulate器官芯片技术构建了一个人源化脂肪变性肝脏芯片模型。肝脏芯片研究的实验设计如图5A和5B所示。通过这个模型，他们能够在体外模拟肝脏组织的环境，并观察脂肪变性对肝脏的影响。在给予能够引起脂肪变性表型的脂肪酸（油酸和棕榈酸）后，通过显微镜观察、免疫荧光分析和基因表达等方法进行研究，结果表明，与形态学和转录组学诱导的MASLD表型一致（IRS1、50、51IRS2、51和PPARa52、53减少；SREBP1c、54 PPARg、55和FABP456增加；图5C和5D）。由于单个肝脏芯片实验中产生的cDNA产量有限，为了更有效地进行研究，他们从先前的蛋白质组学和空间转录组学研究中识别出的33个潜在的靶标中，挑选出了13个靶标，进行进一步的评估。这些靶标被评估的方式有两种：（1）选取了5个在脂肪变性过程中表达上调最显著的靶点（HMGCS1、SERPINE1、HSPA1B、ENO3和HSPA1A），以及全部3个在脂肪变性中下调的靶点（IL1RAP、SHBG和IGFBP2），再加上空间转录组学分析中显示在脂肪变性中上调幅度最小的2个靶点（CDA和PYGL）；（2）另外三个靶标虽然在人类肝脏空间研究中表达存在差异，但在非实质性（非肝细胞）细胞（NPCs）中表达显著；它们是ME1、CTSZ和DEFB1。此外，科学家们还检测了两个肝细胞特异性靶标，这两个靶标是从CARDIA中与肝脏脂肪变性相关的循环蛋白质组中筛选出来的（ACY1和AKR1C4），且与脂肪变性紧密相关，并且作为分泌蛋白具有很高的可信度。
图5肝脏芯片上研究MASLD
在循环蛋白质组、组织转录和肝脏芯片实验中，科学家们观察到了一致的结果：与肝脏脂质代谢、应激反应和非经典通路（例如铁代谢异常）相关的基因（包括PYGL、HMGCS1、SERPINE1、ENO3和HSPA1B；图5E）在肝细胞和/或非实质细胞（NPC）中的表达有所增加。尽管在肝脏芯片实验中，ME1、CSTZ和DEFB1在肝脏芯片的肝细胞中未见表达（与转录组研究一致），但它们在肝脏芯片的NPC中表达却有所增加（图5E）。这些发现与批量转录数据中DEFB1和ME1的批量数据（图4）结果表明：这些基因表达水平的增加可能是由非肝细胞来源的细胞所引起的。
为了评估在肝脏芯片上诱导脂肪变性是否会导致这些靶标在蛋白质水平上的表达增加，科学家们随后测量了在肝脏芯片上唯一可接触到的肝细胞和NPC流出物中的靶标。他们选择了在肝脏芯片实验中15个在肝细胞中mRNA水平差异表达基因中的7个，这些基因具有细胞外分泌的高可信度细胞蛋白靶点，并且具有可用于评估肝脏芯片实验流出物的商业ELISA试剂盒（HMGCS1、SERPINE1、PYGL、CTSZ、DEFB1、ACY1和AKR1C4；图5）。科学家们注意到，在肝脏芯片的细胞流出物中，HMGCS1、SERPINE1、CTSZ、DEFB1、PYGL、ACY1和 AKR1C4的蛋白质水平表达一致（图5F），这表明细胞类型特异性蛋白质分泌与肝脏芯片上的转录变化和群体水平的蛋白质组方向性相匹配。有趣的是，转录组数据中非肝细胞特异基因编码的分泌蛋白（并在科学家们的肝脏芯片数据中的mRNA表达水平上得到验证）仅在非肝细胞的流出液中检测到（CTSZ和DEFB1）。相反，仅在肝细胞通道中检测到肝细胞特异性蛋白（ACY1和AKR1C4）。
肝脂肪变性是多系统代谢功能障碍的核心表型，随着肥胖症的流行而日益严重。科学家们采用一种综合临床表型、循环蛋白质组学和组织转录组学的转化策略，来寻找可以反映肝脂肪变性的动态功能的生物标志物。他们利用多模态成像和广泛的蛋白质组分析，鉴别出与肝脏脂肪变性进展有关的蛋白质，这些蛋白质主要由在人类肝脏中转录水平丰富的基因编码。在空间转录组学研究中，这些转录本在不同的脂肪变性区域有不同的表达模式，其中一些在脂肪变性阶段是动态的。脂肪变性的循环多蛋白特征与脂肪肝和多系统代谢结果密切相关。科学家们利用人源化肝脏芯片模型诱导肝脂肪变性，验证了优先靶点的细胞特异性表达。这些发现凸显了该方法在评估人类肝脏的预后、功能以及动态“液体活检 ”方面的实用性，为寻找新的生物标志物和机理研究开辟了新的途径提供新思路。
